qPCR实验

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，加入荧光染料SYBR或荧光标记的特异性探针测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。

通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行相对定量或绝对定量。

实验方法：

1. SYBR Green法：

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

优点：价格便宜、可以与任何PCR产物结合。

2. TaqMan探针法：

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

优点：荧光背景低、稳定性好、特异性高、灵敏度高。

SYBR Green法qPCR原理图